Western Blot蛋白免疫質組

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實驗原理

蛋白質印跡（Western Blot）又稱為免疫印跡（Immunoblot），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣本中的某種蛋白的一種分子生物學技術。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

實驗步驟和結果分析

1. 蛋白質抽提

實驗對象為組織樣品，取適量（約150mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加0.3-0.4ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后冰上裂解，離心抽提總蛋白（或核蛋白）。

實驗對象為細胞樣品，每份樣品取 1×10⁶～1×10⁷細胞，PBS清洗細胞以去除血清等培養添加物，去PBS加0.1-0.2ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）,冰上裂解，離心抽提總蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白質定量

按BCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

將準備好的樣品液和預染蛋白marker分別上樣，標準加進第一個孔中，80v電泳濃縮膠，100v電泳分離膠。

4. 蛋白質轉移到NC膜

按Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素膜夾層（黑膠白膜三明治模型），100v恒壓條件下轉膜，選定轉膜時間（1KD/1min）。

5. Western blot膜的封閉和抗體孵育

· 膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。